帕金森?。≒D）是一種神經退行性運動障礙，其特征是黑質致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）的多巴胺（dopamine, DA）神經元逐漸喪失，導致背側紋狀體（dorsal striatum, DSt）中的多巴胺水平下降。這種多巴胺的缺失通過改變紋狀體回路引起運動障礙，最終導致直接和間接通路的輸出失衡，這些通路分別由表達D1受體（dMSNs）或D2受體（iMSNs）的中型棘狀神經元組成。多巴胺的耗竭還被認為會增加主要來自局部膽堿能中間神經元（cholinergic interneurons, ChIs）的紋狀體乙酰膽堿（acetylcholine, ACh）。根據DA-ACh平衡假說，多巴胺的喪失和乙酰膽堿的增加是導致帕金森運動功能障礙的主要病理因素。然而，盡管乙酰膽堿在紋狀體中很重要，但多巴胺耗竭如何具體改變膽堿能傳遞和受體激活仍不清楚，因為在不同的PD模型中，關于ChI興奮性和ACh水平變化的結果存在矛盾。

除了紋狀體煙堿受體的回路效應外，乙酰膽堿還通過突觸后G蛋白偶聯的毒蕈堿受體直接調節MSNs。所有MSNs都表達Gq偶聯的M1受體，但Gi/o偶聯的M4受體主要表達在dMSNs中。M4受體被認為是參與DA-ACh相互作用的主要毒蕈堿亞型，通過解碼ChI的放電模式和調節DA傳遞及相關的運動行為來發揮作用。M4受體通過調節多巴胺的突觸前釋放和突觸后反對Golf/s偶聯的D1受體信號傳導，參與運動功能的控制，并調節皮質紋狀體突觸可塑性的誘導。因此，根據PD背景下的DA-ACh平衡假說，多巴胺喪失后乙酰膽堿水平的增加可能會轉化為增強的M4信號和減少的dMSNs中的D1信號，導致直接通路的整體抑制和運動的抑制。為了抵消多巴胺的耗竭，標準的PD治療使用前體左旋多巴（3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, L-DOPA），但隨著疾病進展，最終會導致稱為左旋多巴誘導的運動障礙（levodopa-induced dyskinesia, LID）的異常不自主運動。然而，迄今為止，尚未直接確定PD中多巴胺喪失后或LID中L-DOPA治療后M4信號如何改變。

科羅拉多大學的Beatriz E. Nielsen和Christopher P. Ford*在研究多巴胺耗竭的小鼠時發現，直接通路中M4介導的膽堿能信號傳導并沒有增加，反而由于dMSNs中突觸后M4受體功能的減弱而減少。這種細胞亞型和突觸特異性的適應對神經回路有廣泛影響，并且動態依賴于多巴胺水平。恢復異常的M4信號意外地緩解了帕金森運動缺陷和L-DOPA誘導的運動障礙行為。他們的研究結果揭示，減少的直接通路M4傳遞可能在帕金森病的病理生理和L-DOPA誘導的運動障礙進展中起到潛在且以前未被注意到的作用。該研究成果以Reduced striatal M4-cholinergic signaling following dopamine loss contributes to parkinsonian and L-DOPA–induced dyskinetic behaviors為題發表在Science Advances上。

圖源 Science Advances

首先，研究人員為了探究多巴胺（DA）耗竭對直接通路中M4介導的膽堿能信號傳導的影響，向小鼠的內側前腦束（medial forebrain bundle, MFB）單側注射高劑量（4μg）的6-羥基多巴胺（6-OHDA），以誘導紋狀體DA輸入的幾乎完全退化，而對照組動物則注射生理鹽水。在6-OHDA注射后3-4周，背側紋狀體（DSt）和黑質致密部（SNc）中的酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）免疫反應性減少。正如預期的那樣，DA系統的損傷導致了運動障礙，研究人員通過圓柱測試和旋轉桿測試進一步評估。盡管DA的喪失被預測會驅動紋狀體乙酰膽堿（ACh）水平的增加，但這種變化如何轉化為改變的膽堿能傳遞仍不清楚。因此，研究人員還檢查了DA損傷動物中dMSNs在M4受體突觸上的ACh傳遞變化。結果表明，6-OHDA處理的小鼠中M4-IPSCs的幅度顯著減少，即通過M4受體傳遞到dMSNs的膽堿能傳遞在多巴胺能輸入退化后減少。進一步的實驗還驗證了乙酰膽堿酯酶（AChE）介導的ACh清除功能沒有變化，說明膽堿酯酶介導的ACh清除沒有功能性改變。

在帕金森病小鼠模型中，研究人員通過圓柱測試和旋轉桿測試評估運動功能。圓柱測試用于評估前肢使用的不對稱性，小鼠被單獨放置在一個透明的塑料圓柱體中，后方放置鏡子以便觀察，并進行5分鐘的視頻錄制以便后續評分。錄制前不進行任何適應訓練，僅記錄小鼠用完全伸展的爪子接觸圓柱壁的次數。數據以注射側對側前肢觸碰次數占總前肢使用次數的百分比表示。圓柱測試中運動缺陷的存在被用作將小鼠納入帕金森實驗組的標準，并設定對側爪使用率低于40%為閾值。小鼠的旋轉桿測試則用于評估運動平衡和協調能力，采用從3到30轉/分鐘的加速協議，持續5分鐘。每只小鼠在同一天進行三次試驗，每次試驗間隔10分鐘，同樣不進行事先訓練。記錄小鼠掉落的潛伏期或達到最大速度的時間，數據取兩次最佳試驗的平均值。通過這些測試，研究人員能夠量化帕金森病模型小鼠的運動功能缺陷，并評估潛在治療方法的效果。

圖1 DA耗竭減少M4介導的膽堿能突觸傳遞

為了探究DA耗竭對直接通路中M4介導的膽堿能信號傳導的影響，研究人員向小鼠的MFB單側注射6-羥基多巴胺（6-OHDA），以誘導紋狀體DA輸入的退化。結果顯示，6-OHDA處理的小鼠中M4-IPSCs的幅度顯著減少，表明M4受體信號傳導的減少是由于突觸后M4受體功能的減弱，而非GIRK2表達的差異，部分原因是M4受體表達的減少。研究還在MitoPark小鼠模型中驗證了這一發現，該模型通過選擇性敲除線粒體轉錄因子A（Tfam）基因導致DA神經元的線粒體功能障礙和逐漸退化。結果表明，MitoPark小鼠中M4-IPSCs的幅度和Oxo-M（oxotremorine-M）誘導的最大外向電流均減少。此外，通過測量M4受體介導的電壓門控鈣通道（voltage-gated calcium channels, VGCCs）抑制，研究人員發現DA耗竭后dMSNs中M4受體信號傳導減少。這些結果表明，DA耗竭導致的直接通路M4信號傳導減弱，可能在帕金森病的病理生理中起重要作用。

圖2 DA耗竭降低dMSNs突觸后M4受體功能

為了恢復傳導功能的損傷，研究人員設計了一種腺相關病毒Adeno-associated virus, AAV），編碼Cre依賴的M4受體和熒光報告蛋白增強型綠色熒光蛋白（eGFP），以測試在dMSNs中選擇性過表達是否能挽救帕金森小鼠中的膽堿能信號缺陷。注射AAV.DIO.M4.eGFP三周后，注射半球的M4免疫反應性增加了約25%。在D1-Cre小鼠中共同注射AAV.DIO.M4.eGFP和AAV.DIO.GIRK2.T2A.tdTomato，導致重疊神經元群體中廣泛表達eGFP和tdTomato熒光。記錄顯示，M4過表達小鼠中M4-IPSCs和Oxo-M誘導的M4介導外向電流的幅度均大于對照小鼠。M4受體的過表達恢復了DA耗竭后M4介導的膽堿能傳導的損傷。盡管M4信號傳導被認為在直接通路中起到抑制作用，但研究發現，M4受體的過表達改善了帕金森小鼠在平衡和協調任務中的運動表現（如旋轉桿和平衡梁測試）。M4過表達小鼠在這些任務中的表現與對照組相似，表明恢復M4介導的膽堿能傳導可以改善帕金森運動障礙，而不會進一步損害運動功能。

圖3 M4受體在dMSNs中的過度表達可恢復帕金森小鼠膽堿能傳遞并改善運動缺陷

圖3 M4受體在dMSNs中的過度表達可恢復帕金森小鼠膽堿能傳遞并改善運動缺陷

為了探究M4受體突觸后功能減少的原因，研究人員生成了選擇性缺失G蛋白信號調節蛋白（RGS4）的dMSNs小鼠。RGS4調節Gq和Gi/o偶聯的G蛋白偶聯受體（GPCRs）信號傳導，缺失RGS4的小鼠中M4-IPSCs的幅度增加，激活和去激活的動力學延長，表明RGS4在調節dMSNs中的M4信號傳導中起重要作用。最大外向電流也增加，而M4受體的敏感性未受影響。接下來，研究人員在6-OHDA處理的小鼠中進行了完全的DA損傷，發現缺失RGS4的小鼠中M4-IPSCs的幅度恢復到與生理鹽水處理的對照組相似。選擇性缺失RGS4的小鼠在旋轉桿和開放場運動活動中的表現略有受損，但在校正這些基礎損傷后，發現6-OHDA處理的小鼠中運動功能得到恢復，包括旋轉桿上的滯留時間和穿越平衡梁的時間。缺失RGS4的小鼠在平衡梁測試中的基礎表現未受影響，但在6-OHDA誘導的運動缺陷中表現出部分恢復，包括穿越梁的時間減少、腳滑次數減少和由于啟動運動猶豫導致的不成功試驗百分比減少。這些結果表明，DA損傷后突觸后M4功能的減少可能導致帕金森運動功能障礙的某些方面。

圖4 在dMSNs中選擇性消融RGS4可以恢復M4傳遞，并緩解帕金森小鼠的運動障礙

為了探究DA耗竭后M4膽堿能傳導減少對L-DOPA誘導的運動障礙行為的影響，研究人員在6-OHDA處理的小鼠中選擇性去除dMSNs中的RGS4蛋白，并進行每日L-DOPA注射。結果顯示，盡管L-DOPA治療恢復了運動功能，但未能逆轉M4功能的減少。通過分析運動活動和旋轉頻率，發現RGS4缺失小鼠在L-DOPA治療后運動功能得到改善，同時不影響其治療效果。此外，RGS4缺失小鼠的異常不自主運動評分顯著降低，表明恢復M4功能可以減輕L-DOPA誘導的運動障礙行為。這些結果表明，DA耗竭后直接通路中M4介導的膽堿能傳導減少加速并加重了L-DOPA誘導的運動障礙，而恢復M4功能則改善了運動障礙行為，同時不影響L-DOPA的抗帕金森效果。

圖5 M4傳遞的恢復減輕了L-DOPA引起的運動障礙行為

這項研究表明，多巴胺（DA）耗竭后，直接通路中M4介導的膽堿能信號傳導減少，這種減少與帕金森?。≒D）和左旋多巴（L-DOPA）誘導的運動障礙行為密切相關。研究人員通過恢復M4受體的功能，發現該方法可以部分緩解帕金森病的運動缺陷和L-DOPA誘導的運動障礙行為。這一研究發現揭示了M4受體在PD病理生理學中的潛在作用，并為未來的治療策略提供了新的方向。未來的研究可以進一步探討M4受體在不同PD模型中的作用，并開發針對M4受體的特異性藥物，這可能為帕金森病和L-DOPA誘導的運動障礙提供更有效的治療方法。此外，還可以探索其他膽堿能信號傳導途徑在PD中的作用，也將有助于全面理解該疾病的復雜機制。

原文地址：https://doi.org/10.1126/sciadv.adp6301

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