疼痛是一種保護身體的不愉快體驗，它通過引發自衛反應來保護身體免受傷害。近年來，已有多項研究對大腦高級中樞的神經回路和分子機制進行了解析，在理解疼痛調節方面取得了突破性進展。然而大腦如何處理來自身體不同部位的痛覺信號，以及這些信號如何導致不同的感知和行為反應，這些機制尚不完全清楚。疼痛可以分為內臟痛和軀體痛兩種不同的痛覺類型，它們雖然在大腦中有共同的神經區域，但引發不同的行為反應。內臟刺激會引發腹部的收縮反應，而體表刺激會導致后肢撤回或舔舐等行為，但不會引發腹部的收縮反應。盡管人們對疼痛的傳遞和調節已有深入了解，但關于大腦如何編碼內臟和軀體刺激以產生不同感知和行為的具體機制，仍然是一個未解之謎。傳統認為這兩種疼痛由大腦中的兩個不同系統分別進行處理：內側疼痛系統和外側疼痛系統。然而，缺乏實質性證據支持這種假設性的不同處理。最近的一項功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）的研究發現，內臟痛和軀體痛實際上都激活了相同的腦區，如中腦、小腦、海馬體、島葉皮層、丘腦和下丘腦等，這表明內臟痛和軀體痛的處理可能并不像之前認為的那樣完全分離。因此，對于這兩種疼痛在大腦中的具體識別和編碼方式，還需要進一步的研究來闡明。

摘要圖

下丘腦室旁核（paraventricular hypothalamus, PVH）是腦中一個關鍵的核團，對多種生理過程起著至關重要的作用，包括內臟和軀體疼痛、恐懼、焦慮和進食。蘇州大學徐廣銀教授團隊在在Neuron雜志上發表研究論文Distinct circuits and molecular targets of the paraventricular hypothalamus decode visceral and somatic pain，認為內臟刺激和軀體刺激會在PVH中誘導不同的神經集群，從而形成對疼痛信號的特異性處理和后續行為輸出。研究團隊通過多項先進的技術手段驗證了內臟痛和體表痛會激活PVH中不同的神經元群，這些神經元群分別投射到外側隔核（lateral septal nucleus, LSV）和未定帶（zona incerta, ZIC）的不同區域，從而分別介導內臟痛和體表痛。

圖源 Neuron

為了研究由內臟和軀體疼痛激活的神經系統在PVH中的表現，我們使用了Tet-off病毒系統并結合了c-Fos染色（圖1）。研究人員將AAV2/9-c-fos-tTA和AAV2/9-TRE3g-mCherry混合注射到PVH，使小鼠接受內臟疼痛刺激，結腸擴張（colorectal distention, CRD）激活的PVH神經元群能被mCherry標記。在灌注前1.5小時，小鼠接受了VFF（von Frey filament）刺激，且VFF激活的 PVH 神經元群將被c-Fos染色標記。通過mCherry表達和c-Fos染色證明了PVH神經元群激活的分布，發現這些神經元群被內臟和體感覺疼痛同時激活。該實驗的結果表明，40.68%的PVH神經元僅表達腹部疼痛引起的mCherry，36.65%僅表達體表疼痛激活的c-Fos，23.67%表達兩種疼痛的mCherry和c-Fos。PVH神經元的數量在腹部和體表疼痛中沒有顯著差異，但mCherry和c-Fos雙陽性神經元的百分比顯著低于mCherry或c-Fos單陽性神經元。這表明CRD和VFF激活的PVH神經元是兩個相對獨立的人群，專門識別腹部疼痛和體表疼痛信號。

圖1 腹腔和體表疼痛激活的神經元群在PVH中的表現

內臟和軀體疼痛激活不同的PVH神經系統，可能是由于不同的分子表達。因此，為了研究標記為CRD和VFF的PVH神經元群體的分子特征，研究人員采用了一種名為fLCM-seq的新方法。他們利用Tet-off系統結合c-Fos染色，特異性地標記了CRD和VFF激活的PVH神經元群，并通過激光捕獲顯微解剖技術（laser capture microdissection, LCM）以單細胞分辨率精確收獲了標記為CRD、VFF和CRD和VFF共標記的細胞。隨后，研究人員檢查了這三組PVH神經集體的轉錄水平差異，計算高度可變基因并進行PCA分析。結果發現來自同一神經集體的細胞形成了明顯不同的聚類，說明這三組PVH神經集體的轉錄水平存在顯著差異；通過LCM分析獲得的細胞類型，發現這三組PVH主要由谷氨酸能神經元組成，且幾乎沒有抑制性神經元，與之前關于PVH主要由谷氨酸類神經元組成的結論一致。通過計算差異表達基因（DEGs），研究人員發現P2rx3在CRD標記組高度特異性表達，Vipr2在VFF標記組高度特異性表達。P2X3R和VIPR2在疼痛調節過程中發揮關鍵作用。進一步的基因功能分析表明，CRD標記組中多個基因參與了正向調節疼痛感知的生物過程，VFF標記組中多個基因與激活腺苷酸環化酶活性相關。這些發現表明P2X3R可能特異性與臟器疼痛調節相關，VIPR2可能特異性與皮膚疼痛調節相關。

圖2 PVH 神經集群中CRD標記和VFF標記的神經元群體顯示出明顯不同的轉錄譜

研究人員對P2X3R和VIPR2在CRD標記和VFF標記的PVH神經元上的表達進行了免疫熒光驗證。結果表明，CRD標記的PVH神經元中61.10%表達P2X3R，而VFF標記的PVH神經元中只有1.09%表達P2X3R；VFF標記的PVH神經元中53.58%表達VIPR2，而CRD標記的PVH神經元中只有1.69%表達VIPR2。這些結果表明P2X3R和VIPR2特異性表達在CRD標記和VFF標記的PVH神經元上。此外，研究人員使用ATP或VIP傳感劑，檢驗ATP和VIP是否在腹部疼痛或肌肉疼痛刺激下特異性釋放，其結果表明，在CRD或VFF刺激下，PVH中表達ATP傳感劑的神經元顯示出銳利的反應，而在肌肉疼痛刺激下則沒有反應。同樣地，將AV2/9-hSyn-VIP1.7注射到PVH中，以評估VFF或CRD刺激期間VIP的釋放，發現PVH中表達VIP傳感劑的神經元在肌肉刺激下顯示出顯著反應，但在腹部疼痛刺激下沒有反應。總之，腹部和肌肉疼痛刺激可以選擇性增加ATP和VIP釋放，這表明ATP-P2X3R和VIP-VIPR2通路可能是PVH如何區分性調節腹部和肌肉疼痛的機制。

圖3 PVH神經集群中帶有CRD和VFF標記的細胞明顯地表達P2X3R和VIPR2蛋白

本研究涉及到了一組小鼠的疼痛相關的行為學實驗模型。在內臟疼痛實驗中，通過結直腸擴張CRD進行評估，小鼠用異氟烷輕度麻醉，然后將一個定制的彈性聚丙烯氣球（2厘米，氣球是由將手術手套的指頭連接到輸液管上制成的）插入結直腸，放置在肛門3厘米處，氣球末端的輸液管用壓敏膠帶牢固地固定在老鼠的尾巴上，以防止滑落或脫落。在結直腸擴張之前，讓老鼠在單獨的透明盒中適應30~60分鐘。氣球用血壓計緩慢均勻地充氣，直到老鼠出現明顯的腹部收縮反應，以此確定內臟痛閾值。每只老鼠接受5次，間隔3分鐘的重復結直腸擴張。所有內臟痛行為測試均采用盲法進行。在體表疼痛實驗中，使用纖毛機械刺激針（von Frey filaments, VFF）誘導后肢撤回反應進行評估，為了盡量減少環境干擾，在進行體表痛行為測試前3天，讓小鼠熟悉測試環境。測試前，將小鼠放入一個專門的透明盒（4.5×3.5×10.0厘米）中，底部有升高的網格，并讓其適應30~60分鐘。將一系列校準的Semmes-Weinstein monofilaments從0.008 - 2g的壓力應用于后爪的足底表面，直到小鼠應激并退出刺激。陽性反應包括突然的爪子撤回、抽搐和舔爪。每次將每個VFF應用于后肢足底5次（每次保持3秒），其中引起3次陽性反應的VFF的最小彎曲力被認為是爪子撤回閾值。所有體表疼痛行為測試也都采用盲法進行。

該研究發現，PVH神經元可以通過不同的神經回路和分子機制分別調控內臟疼痛和體性疼痛。具體來說，PVH中的P2X3R+神經元通過投射到腹外側隔核LSV來調控內臟疼痛,而VIPR2+神經元則通過投射到前扣帶皮質ACC來調控體性疼痛。這表明PVH內存在功能分化的神經亞群,能夠對不同類型的疼痛信號進行獨立編碼和調控。P2X3R+神經元通過釋放ATP激活LSV中的神經元從而誘發內臟疼痛相關行為，而VIPR2+神經元則通過釋放VIP激活ACC中的神經元從而誘發體性疼痛相關行為。這些發現揭示了PVH神經元調控不同疼痛類型的具體分子機制。

總而言之，這項研究揭示了PVH神經元在內臟疼痛和體性疼痛調控中的分子和神經回路機制，為進一步理解疼痛的中樞編碼和調控提供了重要線索。未來的研究可以進一步探討PVH神經元與其他腦區的相互作用，以及其在慢性疼痛發生發展中的作用，為疼痛的精準調控治療提供新的靶點。

找實驗方法，上腦聲常談。

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