酒精使用障礙在全球范圍內(nèi)極為普遍，其特征是在戒斷期間會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的疼痛敏感性。

基于此，2024年9月27日中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物物理與神經(jīng)生物學(xué)系張智研究團(tuán)隊(duì)在Science Advances雜志發(fā)表了“A neural circuit for alcohol withdrawal–induced hyperalgesia in a nondependent state”揭示了非依賴狀態(tài)下酒精戒斷引起的痛覺過敏的神經(jīng)回路。

在這里，作者建立了一個(gè)在成癮之前酒精戒斷（EW）期間痛覺過敏的小鼠模型，以研究其發(fā)病窗口和潛在機(jī)制。通過體內(nèi)顯微內(nèi)窺鏡和雙光子鈣成像的能技術(shù)，確定了從背側(cè)海馬CA1谷氨酸能神經(jīng)元（dCA1Glu）到前扣帶皮層谷氨酸能神經(jīng)元（ACCGlu）的神經(jīng)回路通路，該通路在EW小鼠的痛覺過敏中被激活。化學(xué)遺傳學(xué)抑制這一通路可以減輕EW小鼠的痛覺過敏，而激活則在未經(jīng)EW的小鼠中重現(xiàn)了EW誘導(dǎo)的痛覺過敏。這些發(fā)現(xiàn)表明，在小鼠對(duì)酒精產(chǎn)生依賴之前，dCA1Glu到ACCGlu的神經(jīng)通路參與推動(dòng)EW誘導(dǎo)的痛覺過敏。

圖一 在非依賴狀態(tài)下，小鼠的酒精戒斷誘導(dǎo)痛覺過敏

以前建立酒精依賴小鼠模型的方法是通過慢性間歇性酒精暴露，動(dòng)物至少接受一個(gè)月（平均）的四個(gè)重復(fù)周期的酒精蒸汽暴露，或至少連續(xù)3周自由飲用液態(tài)酒精。因此，為了探索短期飲酒戒斷對(duì)小鼠疼痛敏感性的影響，作者縮短了暴露時(shí)間，建立了一個(gè)連續(xù)飲酒的小鼠模型，允許小鼠自由飲用20%的酒精兩周，每六天有24小時(shí)的戒斷期。在第二次戒酒酒精消耗后24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)在用von Frey刺激戒酒組（EW組）小鼠右后爪時(shí)，其機(jī)械閾值顯著低于對(duì)照組小鼠。相比之下，通過Hargreaves測(cè)試評(píng)估的熱閾值在EW小鼠和對(duì)照組之間沒有顯著差異。

作者在EW期間觀察到的機(jī)械閾值降低可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)3天。此外，在對(duì)照組小鼠中，機(jī)械或熱閾值沒有觀察到變化。然后作者使用曠場(chǎng)測(cè)試（OFT）和高架十字迷宮（EPM）測(cè)試了兩周的酒精消耗戒斷是否也伴隨著焦慮樣情感障礙，結(jié)果顯示，在進(jìn)入中心區(qū)域的頻率或在OFT測(cè)試中運(yùn)動(dòng)的距離沒有顯著差異，在EPM測(cè)試中進(jìn)入開放臂的頻率或在開放臂中花費(fèi)的時(shí)間也沒有明顯差異。為了進(jìn)一步測(cè)試EW小鼠是否發(fā)展為酒精依賴或保持非成癮狀態(tài)，在第二次戒斷期后兩周的酒精消耗期間，對(duì)兩組小鼠進(jìn)行了偏好測(cè)試。EW組和對(duì)照組小鼠都表現(xiàn)出對(duì)蔗糖的高度偏好和對(duì)酒精的非常低的消耗，而在EW組和對(duì)照組小鼠之間，蔗糖或酒精的攝入量沒有差異，這表明EW小鼠保持了與對(duì)照組小鼠相當(dāng)?shù)膶?duì)蔗糖的高度偏好，在連續(xù)兩周的酒精消耗后，對(duì)酒精沒有明顯的偏好。

此外，作者還量化了這種范式下小鼠的酒精消耗量，發(fā)現(xiàn)兩周內(nèi)酒精攝入量沒有變化。還通過收集EW小鼠的尾靜脈血測(cè)試了血漿酒精濃度，發(fā)現(xiàn)第一次和第二次戒斷后血漿酒精濃度沒有差異，這表明在連續(xù)酒精暴露后血漿酒精濃度保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。此外，血漿酒精濃度在2小時(shí)后逐漸降低，比第二次戒斷后降低明顯，并且在第二次EW后8小時(shí)無法檢測(cè)到。此外，作者發(fā)現(xiàn)EW小鼠的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組小鼠相比沒有差異，這表明當(dāng)前研究中兩周的連續(xù)酒精暴露沒有影響小鼠的健康狀態(tài)。這些結(jié)果共同表明，兩周的酒精消耗戒斷可以在小鼠中誘導(dǎo)疼痛敏感化，而不是酒精依賴。

圖二 在戒酒小鼠中dCA1Glu活性增強(qiáng)

海馬尤其是背側(cè)CA1區(qū)域，是大腦中對(duì)酒精敏感的目標(biāo)，可能涉及與急性或慢性酒精消耗或戒斷相關(guān)的疾病。為了探究dCA1在EW誘導(dǎo)的痛覺過敏中的作用及其機(jī)制，作者首先通過免疫熒光染色檢測(cè)這一區(qū)域的c-Fos表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照組小鼠相比，EW小鼠的dCA1中c-Fos信號(hào)顯著增強(qiáng)；為了測(cè)試dCA1Glu神經(jīng)元的神經(jīng)興奮性，在對(duì)照和EW轉(zhuǎn)基因Thy1-黃色熒光蛋白（YFP）小鼠的腦片上進(jìn)行了體外電生理記錄。與對(duì)照組小鼠相比，EW小鼠的dCA1Glu神經(jīng)元活性顯著升高，表現(xiàn)為放電率增加和電流誘發(fā)的動(dòng)作電位的閾值降低，而靜息膜電位沒有明顯變化。此外，作者還進(jìn)行了顯微內(nèi)窺鏡實(shí)驗(yàn)，將GCaMP 6m注射到EW和對(duì)照組C57小鼠的dCA1，以在體內(nèi)直觀觀察dCA1Glu神經(jīng)元活性。EW小鼠的dCA1Glu神經(jīng)元的鈣活性和強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組。這些結(jié)果共同揭示，在小鼠形成依賴之前，短期酒精消耗戒斷期間dCA1Glu神經(jīng)元活性增加。

為了進(jìn)一步探索dCA1Glu神經(jīng)元如何參與疼痛敏感化，作者使用了化學(xué)遺傳學(xué)抑制EW和對(duì)照組小鼠的dCA1Glu神經(jīng)元。行為測(cè)試顯示，與感染對(duì)照病毒的dCA1中的EW小鼠相比，化學(xué)遺傳學(xué)抑制dCA1Glu神經(jīng)元的EW小鼠的機(jī)械閾值顯著升高，而化學(xué)遺傳抑制dCA1Glu神經(jīng)元對(duì)hM4Di-對(duì)照組小鼠的機(jī)械閾值沒有影響。此外，作者還通過化學(xué)遺傳學(xué)激活了未經(jīng)處理的C57小鼠的單側(cè)dCA1，在這些未經(jīng)處理的小鼠中，特異性激活dCA1Glu神經(jīng)元導(dǎo)致對(duì)側(cè)后爪的機(jī)械閾值降低，與感染對(duì)照病毒的小鼠相比，在曠場(chǎng)測(cè)試的總行程沒有變化。此外，根據(jù)廣泛用于評(píng)估癲癇嚴(yán)重程度的Racine量表，作者研究了行為記錄中的癲癇樣行為，如口部和面部運(yùn)動(dòng)、頭部點(diǎn)頭、前肢陣攣、站立和跌倒，而在化學(xué)遺傳學(xué)激活dCA1Glu神經(jīng)元的小鼠中幾乎沒有觀察到癲癇樣行為。這些結(jié)果支持dCA1Glu神經(jīng)元有助于與EW相關(guān)的痛覺過敏。

圖三 戒斷短期飲酒后，前扣帶回谷氨酸能神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)

為了直觀觀察并量化dCA1Glu神經(jīng)元到ACC的投射活動(dòng)，作者在ACC中注射了逆行病毒并進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗記錄。結(jié)果顯示，在第二次戒酒后24小時(shí)，與對(duì)照組相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神經(jīng)元的放電率升高，而電流誘發(fā)的動(dòng)作電位的閾值降低。此外，在第二次戒酒后24小時(shí)，與對(duì)照組小鼠相應(yīng)的神經(jīng)元相比，戒酒小鼠的dCA1Glu神經(jīng)元的鈣信號(hào)明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，在小鼠形成依賴之前，戒酒期間投射到ACC的dCA1Glu神經(jīng)元活動(dòng)增加。免疫熒光染色顯示，戒酒小鼠ACC中c-Fos的表達(dá)高于對(duì)照組動(dòng)物。此外，在EW和對(duì)照組Thy1-YFP小鼠的腦片上進(jìn)行的體外電生理記錄顯示，ACCGlu神經(jīng)元的活性增強(qiáng)，放電率增加，電流誘發(fā)的動(dòng)作電位的閾值相對(duì)于對(duì)照組小鼠降低。

為了在單細(xì)胞水平上觀察ACCGlu神經(jīng)元活動(dòng)的變化，作者進(jìn)行了活體雙光子鈣成像，結(jié)果顯示，在第二次戒酒后24小時(shí)，ACCGlu神經(jīng)元檢測(cè)到的鈣信號(hào)強(qiáng)度顯著增加。為了檢驗(yàn)在連續(xù)短期酒精消耗后戒酒對(duì)ACCGlu神經(jīng)元對(duì)機(jī)械刺激的敏感性，隨后應(yīng)用光纖記錄自由活動(dòng)小鼠的鈣信號(hào)，在第二次戒酒后24小時(shí)，戒酒小鼠右后爪接受0.07克von Frey細(xì)絲刺激后，ACCGlu神經(jīng)元中的鈣信號(hào)迅速增加。為了進(jìn)一步確定機(jī)械刺激對(duì)ACCGlu神經(jīng)元活動(dòng)的影響，在ACC中注射了AAV-CaMKIIα-GCaMP6m病毒的自由活動(dòng)小鼠上進(jìn)行活體顯微內(nèi)窺鏡記錄 ACCGlu神經(jīng)元的鈣信號(hào)度。結(jié)果顯示，在第二次戒酒后24小時(shí)，與對(duì)照組小鼠相比，戒酒小鼠的ACCGlu神經(jīng)元的鈣信號(hào)強(qiáng)度顯著增加。這些結(jié)果表明，在小鼠發(fā)展成依賴之前，敏感化的ACC谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)短期飲酒戒斷后具有重要作用。

總結(jié)：

作者的研究表明dCA1Glu到ACCGlu的神經(jīng)回路在促進(jìn)短期酒精消耗后戒斷引起的痛覺過敏中發(fā)揮功能作用，這種非依賴性酒精消耗與疼痛敏感化的生理聯(lián)系為大腦中不同神經(jīng)系統(tǒng)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)相互作用提供了越來越多的證據(jù)，這些相互作用共同介導(dǎo)了酒精依賴的發(fā)展。