自閉癥譜系障礙（ASD）包括一系列的神經(jīng)發(fā)育疾病。單個(gè)ASD基因的不同突變導(dǎo)致了疾病表型的異質(zhì)性，可能是由于所產(chǎn)生的亞型的功能多樣性。SHANK2是ASD的致病基因，但缺乏以亞型特異性方式研究?jī)?nèi)源性SHANK2蛋白的工具。

基于此，2024年5月4日暨南大學(xué)師玲玲研究團(tuán)隊(duì)在Molecular Psychiatry雜志發(fā)表了“Autism patient-derived SHANK2BY29X mutation affects the development of ALDH1A1 negative dopamine neuron”揭示了自閉癥患者來源的SHANK2BY29X突變影響ALDH1A1陰性多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育。

作者探究了一個(gè)在一例自閉癥患者中發(fā)現(xiàn)SHANK2的點(diǎn)突變，位于SHANK2B轉(zhuǎn)錄變異（NM_133266.5）的外顯子上。該突變導(dǎo)致一個(gè)早期終止密碼子和一個(gè)異常剪接事件，明顯影響SHANK2轉(zhuǎn)錄變異。攜帶這種突變的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），從患者或等基因編輯中，不能分化為功能性多巴胺（DA）神經(jīng)元，這可以通過基因校正來挽救。現(xiàn)有的來自人類中腦的SMART-Seq單細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示，在ALDH1A1陰性的DA神經(jīng)元中有大量的SHANK2B轉(zhuǎn)錄本。然后作者發(fā)現(xiàn)，在體外神經(jīng)元發(fā)育的早期階段，SHANK2BY29X突變主要影響SHANK2B的表達(dá)和ALDH1A1陰性的DA神經(jīng)元。敲除相同突變的小鼠表現(xiàn)出類似自閉癥的行為，腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）的多巴胺釋放減少。

圖一 SHANK2BY29X載體在DA神經(jīng)元分化、樹突形態(tài)和功能方面存在缺陷

作者收集了一個(gè)7歲時(shí)被診斷為自閉癥個(gè)體的信息，該患者表現(xiàn)觸一系列刻板的行為，他還表現(xiàn)出輕微的智力殘疾。在SHANK2（NM_133266.5）上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)從頭異質(zhì)突變c.87C>G，這是ASD的主要風(fēng)險(xiǎn)基因。通過對(duì)WGS數(shù)據(jù)分析證實(shí)了該變異是一個(gè)候選突變，在SHANK2B轉(zhuǎn)錄本變異第1外顯子的一個(gè)等位基因上發(fā)生C到G單核苷酸突變，導(dǎo)致一個(gè)過早終止密碼子，產(chǎn)生SHANK2B p。為了探索由SHANK2BY29X突變導(dǎo)致的ASD相關(guān)的細(xì)胞表型，首先將來自先證者及其未受影響的父親的PBMCs重編程為iPSCs。這些患者分別被稱為患者克隆（PC）和健康克隆（HC）。作者利用ipscs-神經(jīng)元模型闡明SHANK2BY29X突變對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的影響。作者觀察到PC系的神經(jīng)元分化率顯著降低HC線。同時(shí)，TH陽(yáng)性/MAP2陽(yáng)性DA群體顯著減少，這些表型在PC1-res細(xì)胞系中得到挽救。此外，當(dāng)檢測(cè)兩組亞型神經(jīng)元的樹突分枝時(shí)，發(fā)現(xiàn)與HC系相比，PC系中DA神經(jīng)元的樹突長(zhǎng)度和分枝明顯減少。然而，谷氨酸能神經(jīng)元的樹突狀形態(tài)僅顯示出適度的下降，而GABA能神經(jīng)元的數(shù)量保持不變。電生理分析發(fā)現(xiàn)，PC1來源的DA神經(jīng)元的膜電阻降低，細(xì)胞電容增加，峰值鈉離子（INa）閾值升高，INa電流降低。這些異常在PC1-res1細(xì)胞中得到了挽救。結(jié)果表明，SHANK2BY29X突變同時(shí)影響DA的分化、樹突狀形態(tài)和神經(jīng)元的活性。

圖二 SHANK2BY29X優(yōu)先影響ALDH1A1陰性DA神經(jīng)元

SHANK2基因可以產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本，不同的蛋白亞型可能具有特定的功能。SHANK2B保留了PDZ結(jié)構(gòu)域，對(duì)神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要。作者首先通過western blot驗(yàn)證了PC1來源的神經(jīng)元中SHANK2B的缺失，使用亞型敏感的BaseScope探針進(jìn)一步證明了RNA水平上不同亞型的變化。結(jié)果顯示，在PC1來源的神經(jīng)元中，SHANK2B轉(zhuǎn)錄本減少，而SHANK2E轉(zhuǎn)錄本保持不變，而這種減少在PC1-res1細(xì)胞系中可以被挽救。與TH共染色可以顯示患者源性DA神經(jīng)元中SHANK2B表達(dá)降低。此外，在從NPCs分化的5天的神經(jīng)元中微弱檢測(cè)到SHANK2A信號(hào)，但在iPSCs階段更明顯。大量RNA測(cè)序顯示，在神經(jīng)元早期階段，SHANK2和SHANK2B的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)降低。使用兩種不同的引物進(jìn)行qRT-PCR，SHANK2A和SHANK2E轉(zhuǎn)錄本明顯增加，而SHANK2B則降低。這些證據(jù)表明，與未受影響的父系克隆（HC1）相比，ASD患者克隆（PC1）誘導(dǎo)的神經(jīng)元中SHANK2B的RNA和蛋白水平顯著降低，而SHANK2E和SHANK2A在不同發(fā)育階段保持不變或可能代償性增加。通過ALDH1A1和TH共染色發(fā)現(xiàn)，SHANK2 c.87C>G突變明顯影響了hDA1的樹突長(zhǎng)度和復(fù)雜性，而在ALDH1A1陽(yáng)性的TH陽(yáng)性的hDA2神經(jīng)元中，只觀察到樹突分枝的細(xì)微變化。

圖三 SHANK2BY29X KI小鼠在VTA中表現(xiàn)出異常的社交行為和DA神經(jīng)元缺陷

作者運(yùn)用SHANK2BY29X KI小鼠研究SHANK2BY29X如何在細(xì)胞和行為水平上影響體內(nèi)大腦發(fā)育。通過CRISPR/Cas9技術(shù)和同源重組，將Y28X（對(duì)應(yīng)于人Y29X）敲入內(nèi)源性Shank2位點(diǎn)。接下來探討純合子KI小鼠是否被授予自閉癥樣表型。在三箱社交實(shí)驗(yàn)中，WT小鼠表現(xiàn)出對(duì)陌生鼠的偏好，而KI小鼠在第二階段沒有表現(xiàn)出明顯的傾向，表明KI小鼠表現(xiàn)出社交能力的缺陷。作者還注意到KI小鼠表現(xiàn)出異常的刻板行為、多動(dòng)、焦慮和空間學(xué)習(xí)和記憶受損能力。總之，作者證明了SHANK2 c.87C>G突變是一種致病性突變，它在小鼠中誘導(dǎo)類似自閉癥的行為中是十分必要的。作者通過蛋白印跡證實(shí)小鼠VTA中SHANK2BY29X突變帶來的SHANK2B蛋白亞型缺失和TH表達(dá)減少。在解剖水平上，中腦DA的兩個(gè)主要群體分別位于SN和VTA。帕金森病引起的DA神經(jīng)退行性變主要發(fā)生在大多數(shù)Aldh1a1陽(yáng)性DA神經(jīng)元所在的SN。通過FSCV探測(cè)到的NAc中TH的平均熒光強(qiáng)度以及電刺激誘導(dǎo)的NAc釋放在KI小鼠中顯著減少。因此，內(nèi)源性SHANK2B的表達(dá)不僅在VTA中多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育中，而且在基于多巴胺的腦回路的建立中具有重要作用。

總結(jié)：

作者的研究首次證實(shí)了SHANK2B在陰性的ALDH1A1DA神經(jīng)元中的亞型特異性表達(dá)，其中來自ASD患者的SHANK2B功能缺失突變損害了其在體外的生長(zhǎng)和功能。

閱讀原文